双重和多重原位杂交技术 – 实验方法

双重和并联原位杂交技术

    为了在完全同样的标本上或完全同样的细胞内同时检测能否在两种或两种不只是的靶核蛋白质序列。可敷双重或并联原位杂交技术.即以两种或多种特征清楚地发出与靶核蛋白质杂交。多种多样的的靶核蛋白质的在和散布停止检测。该技术是相似地双重或并联特征豁免组化,不计清楚地发出自行的特有的,最后的妨碍睡眠次要是人MAR的相互作用。。

    (1)教育活动核蛋白质和非教育活动核蛋白质双特征原位杂交

    非教育活动特征原位杂交技术的起来和开展,它用于原位杂交双特征补充了无效的技术道路。在将教育活动核蛋白质和非教育活动重要的特征的两种清楚地发出娶停止的双重特征原位杂交技术中,经用的教育活动核蛋白质特征是

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S,经用的非教育活动特征物是维生素H和异羟洋地黄毒苷。。该双重原位杂交技术可分为一花纹循环和二花纹循环两种。一步,原位杂交反敷两清楚地发出混合获得一次。,显示杂交喷射器,链霉素娶碱性磷酸酶特征与娶,密码组合硝酰四氮唑(NBT)和5―溴―4―氯―3―氮茚―汽水(BCIP)作为底物显示杂交体上的碱性磷酸酶(或用ABC法显示杂交体上的维生素H)或以碱性磷酸酶特征的抗异羟洋地黄毒苷对称体与杂交体上的异羟洋地黄毒苷娶,NBT BCIP和显示碱性磷酸酶,脱水和缓和后停止辐射状自显影,以显示另一个T。。一步方式的优点是,杂交反馈噪音是复杂的,手术轻易搬运短,完全同样的单元说话中肯两种喷射器轻易的分辩。;缺陷是辐射状自显影的男子气概的喷射器尖锐的,碱性磷酸酶或ABC的男子气概的反馈噪音制作能够招致核

物质的化学组成

显影。在两花纹循环中,两个私生子先后应用多种多样的的清楚地发出。,普通先用

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s特征清楚地发出原位杂交,辐射状自显影显示优先种杂交体后再用维生素H或异羟洋地黄毒苷特征的清楚地发出停止居第二位的次原位杂交,按维生素H―亲和素―碱性磷酸酶法(或ABC法)或异羟洋地黄毒苷―抗异羟洋地黄毒苷对称体―碱性磷酸酶法显示居第二位的种杂交体。两花纹循环的混合喷射器完全地可辨。。在与radionuc原位杂交优先十足轻易搬运序列,包孕辐射状自显影的成像快跑,mrna的创作无能力的转变。,它无能力的引起目的核蛋白质对清楚地发出的可在附近性。。两花纹循环轻易搬运全快跑比一花纹循环长。,但它心不在焉一步就错过教育活动喷射器。,对碱性磷酸酶男子气概的反馈噪音制作的缺陷。

    (二)非教育活动特征清楚地发出双特征原位杂交

    免得用多种多样的的特征来特征多种多样的的核蛋白质清楚地发出,只需它们不引起彼此的杂交反馈噪音。,检测零碎不相互妨碍睡眠。,穿插喷射器轻易的分辩。,基本上,它用于加强语气于原位杂交两个或多个特征。敷非教育活动特征清楚地发出的双重特征原位杂交。教育活动核蛋白质特征清楚地发出分辩率较低。、牧师教育活动被污染的的缺陷。

    1。维生素H和异羟洋地黄毒苷特征的双特征原位杂交 用维生素H和异羟洋地黄毒苷特征的两个清楚地发出停止双特征。,杂交可以经过有两个镧的混合溶解停止一次。。因维生素H特征清楚地发出用于加强语气辣根过氧化物酶特征的亲和素检测(以3―胺基―9―乙基―卡巴唑为底物,男子气概的反馈噪音制作为白色。,而异羟洋地黄毒苷特征的清楚地发出用碱性磷酸酶特征的抗异羟洋地黄毒苷对称体来检测(反馈噪音制作为蓝色),两个探测零碎互不妨碍睡眠。,因而,特征的抗维生素H和抗异羟洋地黄毒苷对称体也可以混合和孵化。但两种酶的呈色反馈噪音必要的pH先决条件的完全同样的,合乎逻辑的推论是,色反馈噪音应停止两遍。。

    2。双荧光性特征原位杂交 用多种多样的色的荧光性素特征多种多样的的核蛋白质清楚地发出,完全同样的安排或细胞中两种多种多样的靶核蛋白质的检测。用多种多样的的荧光性素作特征物停止双重特征原位杂交,径直法和间接得来的法有两种。。两种多种多样的色的荧光性素用两种多种多样的的核蛋白质特征。,用其做原位杂交,杂交喷射器可以经过多种多样的的选择径直观察到。。这种方式轻易的轻易搬运。,但感性不高。两种多种多样的的核蛋白质清楚地发出用维生素H和异羟洋地黄毒苷特征。,并且用多种多样的荧光性素特征的亲和素(或抗维生素H对称体)和抗异羟洋地黄毒苷对称体来检测杂交体。间接得来的法比径直法敏捷。。

    (三)两种教育活动核蛋白质特征的双特征原位杂交

    用3H和35两个多种多样的的清楚地发出用S特征。,混合清楚地发出原位杂交。辐射状自显影术是辐射状自显影术,标本上植物两层核乳状液。,与核乳状液的两层由透明度塑料胶片区分。因3β射线低能,故3h喷射器在优先层乳状液上。;35高β射线可能。它不独能揭露优先层乳状液。,它还可以穿透塑料胶片来揭露居第二位的层乳状液。,最后35S的喷射器可同时在两层核乳状液中瞧。两层乳状液上的喷射器为白色和蓝色,色为M。,两种混合喷射器在镜下更轻易验明。。

    该方式可以检测SA上多种多样的细胞说话中肯两个靶核蛋白质。,但完全同样的细胞说话中肯两个目的核蛋白质不克不及被验明。。并且,这项技术的轻易搬运是复杂的。、检测快跑必要两遍辐射状自显影。,这必要许久。,因而散发和应用是有限性的。。


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